摘 要 建立一種高效液相色譜柱后衍生法測(cè)定飼料中9種氨基甲酸酯類農(nóng)藥（涕滅威砜、滅多威、3-羥基克百威、涕滅威、速滅威、克百威、甲萘威、異丙威、仲丁威）殘留量的方法。樣品采用乙腈提取，氨基固相萃取柱分離凈化，濃縮，乙腈定容后，進(jìn)行反相色譜梯度洗脫分離、柱后衍生化、熒光檢測(cè)器測(cè)定。結(jié)果表明，9種氨基甲酸酯類農(nóng)藥在22 min內(nèi)能實(shí)現(xiàn)基線分離，方法的回收率為80.0%~110.0%，檢出限為0.01 mg/kg，定量限為 0.05 mg/kg。
關(guān)鍵詞 氨基甲酸酯類農(nóng)藥；飼料；高效液相色譜；柱后衍生
中圖分類號(hào) S816.17
氨基甲酸酯類農(nóng)藥大量使用于玉米、大豆等主要飼料原料的農(nóng)作物生產(chǎn)中,由于氨基甲酸酯類農(nóng)藥毒性較大，通過食物鏈傳遞,處于食物鏈終端的人類是**終的受害者,公眾健康安全受到威脅[1]。目前,該問題越來越被重視,我國(guó)有關(guān)部門已于2003年制定了《飼料中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量測(cè)定氣相色譜法》[2]。但是，由于氨基甲酸酯類農(nóng)藥的極性和熱不穩(wěn)定性，該方法測(cè)定靈敏度和重現(xiàn)性均不是十分理想[3-4]，因此，開展氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量檢測(cè)技術(shù)的研究具有重要意義[5]。本文在查閱相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[6-9]，研究了高效液相色譜法測(cè)定飼料中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的可行性，對(duì)飼料中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的測(cè)定方法進(jìn)行了研究，建立了一種高效、準(zhǔn)確的液相色譜測(cè)定方法。本方法靈敏度高，穩(wěn)定性好，適用于飼料中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的測(cè)定。
1 試驗(yàn)部分
1.1 儀器
Waters 2695高效液相色譜儀，配Waters 2475熒光檢測(cè)器和柱后衍生裝置；3k30型冷凍離心機(jī)（Sigma公司）；B-490旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BüCHI公司);MS2 minishaker旋渦混勻器(IKA公司)；AG-285電子天平（Mettler公司）；20通道固相萃取裝置（Waters公司）。
1.2 試劑與材料
涕滅威砜、滅多威、3-羥基克百威、涕滅威、速滅威、克百威、甲萘威、異丙威、仲丁威標(biāo)準(zhǔn)品均為德國(guó)D.E.公司產(chǎn)品，純度≥96.0％；甲醇、二氯甲烷均為分析純；乙腈為色譜純；無水硫酸鈉為分析純；柱后衍生試劑：0.05 mol/l NaOH溶液和OPA衍生試劑均購(gòu)自美國(guó)Pickering公司；氨基固相萃取柱購(gòu)自杭州富�？萍加邢薰�司��500 mg/6 ml）。
1.3 色譜條件
1.3.1 液相色譜柱條件
Waters Symmetry C18柱，250 mm×4.6 mm，粒徑5.0 μm；進(jìn)樣量：20 μl；流動(dòng)相采用梯度洗脫，條件見表1，柱溫：35 ℃。
1.3.2 柱后衍生條件
水解溫度:85 ℃;堿液:0.05 mol/l NaOH溶液,流速:0.3 ml/min;OPA試劑流速：0.3 ml/min；衍生溫度:室溫。
熒光檢測(cè)器:激發(fā)波長(zhǎng)330 nm;發(fā)射波長(zhǎng)465 nm。
1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
1.4.1 OPA衍生試劑配制
準(zhǔn)確稱取100 mg鄰苯二甲醛,用20 ml甲醇溶解,加入OPA稀釋液940 ml,備用。另取巰基乙醇2.0 g用10 ml OPA稀釋液溶解，轉(zhuǎn)移至上述溶液中，混勻，超聲脫氣，備用。
1.4.2 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
1.4.2.1 單個(gè)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液
準(zhǔn)確稱取適量農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.1 mg），用乙腈溶解，配制成1 000 mg/l的單一農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，貯存于-18 ℃以下冰箱中。使用時(shí)根據(jù)需要吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用乙腈稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作液。
1.4.2.2 農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液
準(zhǔn)確吸取一定體積的單個(gè)農(nóng)藥儲(chǔ)備液于同一容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,配制成農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,使用前用乙腈稀釋成所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
1.5 樣品處理
1.5.1 試樣制備
實(shí)驗(yàn)室樣品經(jīng)混合均勻后,按四分法縮減至100 g,粉碎,使之完全通過0.45 mm篩孔，再充分混合，備用。
1.5.2 提取
準(zhǔn)確稱取試樣（5±0.1） g置50 ml離心管中，加20 ml乙腈，渦旋1 min，6 000 r/min離心5 min，分出上清液，過無水硫酸鈉，收集于茄心瓶中，剩余物用20 ml乙腈重復(fù)提取一次，過無水硫酸鈉，收集于同一茄心瓶中，50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，備用。
1.5.3 凈化
用4 ml甲醇-二氯甲烷(體積比為1：99)溶解茄心瓶?jī)?nèi)物質(zhì),轉(zhuǎn)移至固相萃取柱(使用前用4 ml甲醇-二氯甲烷平衡)中,收集流出液。再用4 ml甲醇-二氯甲烷(體積比為1：99)洗茄心瓶,重復(fù)一次,收集洗脫液,在50 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干,用乙腈定容至2.0 ml,過0.45 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。
1.5.4 色譜分析
分別吸取20 μl標(biāo)準(zhǔn)混合溶液和凈化后的樣品溶液注入液相色譜儀中，以保留時(shí)間定性，以峰面積定量。
2 結(jié)果與討論
2.1 流動(dòng)相的選擇
試驗(yàn)中我們考察了甲醇-水、乙腈-水體系作為流動(dòng)相對(duì)氨基甲酸酯類農(nóng)藥的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇-水、乙腈-水可以對(duì)氨基甲酸酯類農(nóng)藥實(shí)現(xiàn)分離，當(dāng)乙腈-水體系作為流動(dòng)相時(shí)，待測(cè)物氨基甲酸酯類農(nóng)藥的響應(yīng)信號(hào)較強(qiáng)，分離效果更好，而甲醇-水體系流動(dòng)相的極性雜質(zhì)較多，個(gè)別峰峰形不理想，干擾較大，響應(yīng)信號(hào)較低，故我們選擇乙腈-水體系作為流動(dòng)相，具體配比見表1。不同流動(dòng)相體系圖譜比較見圖1，上機(jī)液濃度為200 ng/ml。

2.2 提取溶劑的選擇
由于氨基甲酸酯類農(nóng)藥難溶于水,較易溶于甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。我們分別選擇甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯作為提取溶劑,在同一添加水平,相同實(shí)驗(yàn)條件下,對(duì)樣品進(jìn)行回收率試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明,使用乙酸乙酯、丙酮的回收率明顯低于甲醇、乙腈作為提取劑的回收率,而甲醇使樣品基質(zhì)干擾較大,圖譜基線漂移較大,因此,本方法采用乙腈作為提取劑。
2.3 固相萃取柱條件的選擇
根據(jù)查閱的資料，我們選擇了氨基固相萃取柱作為凈化柱，凈化樣品，洗脫劑選擇甲醇-二氯甲烷（1：99）,對(duì)洗脫劑的用量進(jìn)行了考察,結(jié)果表明,回收率隨洗脫劑體積增加而增加，當(dāng)體積達(dá)到8 ml(4 ml+4 ml)后，繼續(xù)增加洗脫液對(duì)回收率的影響不大。
采用以上確定的前處理方法，進(jìn)行方法學(xué)考察，對(duì)配合飼料添加濃度為40 ng/g的樣品進(jìn)行檢測(cè)，所得空白樣品和添加樣品色譜圖見圖2。

2.4 線性方程和檢出限
配制氨基甲酸酯類農(nóng)藥濃度20.0~500 μg/l的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3節(jié)建立的儀器條件進(jìn)行測(cè)定。分別以峰面積Y對(duì)含量X（μg/l）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，9種農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)r均大于0.999 5，在20.0~500 μg/l范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。以3倍信噪比為檢出限(LOD)，9種待測(cè)農(nóng)藥的檢出限達(dá)到0.01 mg/kg，定量限（LOQ）為0.05 mg/kg。

2.5 回收率試驗(yàn)
取同一批號(hào)的空白配合飼料樣品，加適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，使加標(biāo)量為0.05、0.10、0.50 mg/kg，按1.5節(jié)的方法處理后進(jìn)行儀器分析。每個(gè)濃度點(diǎn)取5份樣品，求其平均回收率，并計(jì)算批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果詳見表2。

由表2的數(shù)據(jù)可知，飼料中9種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的加標(biāo)量為0.05、0.10、0.50 mg/kg時(shí)，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在11.5%以內(nèi)，平均回收率在80％以上。在此基礎(chǔ)上，把建立的方法應(yīng)用于濃縮料、預(yù)混合飼料、單一飼料等樣品的測(cè)定，均取得了滿意結(jié)果。
3 結(jié)論
本文建立了以乙腈為提取劑、經(jīng)氨基固相萃取柱凈化、高效液相梯度洗脫分離、熒光檢測(cè)器檢測(cè)，定性、定量測(cè)定飼料中9種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的方法。該方法測(cè)定農(nóng)藥種類較多，操作過程簡(jiǎn)單，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，是測(cè)定飼料中氨基甲酸酯類農(nóng)藥行之有效的方法。